Faktor gangguan ing reaksi PCR

Sajrone reaksi PCR, sawetara faktor sing ngganggu asring ditemoni.
Amarga sensitivitas PCR sing dhuwur banget, kontaminasi dianggep minangka salah sawijining faktor paling penting sing mengaruhi asil PCR lan bisa ngasilake asil positif palsu.
Sing ora kalah penting yaiku macem-macem sumber sing nyebabake asil negatif palsu. Yen siji utawa luwih bagean penting saka campuran PCR utawa reaksi amplifikasi dhewe dihambat utawa diganggu, uji diagnostik bisa kaganggu. Iki bisa nyebabake efisiensi sing mudhun lan malah asil negatif palsu.
Saliyané inhibisi, ilangé integritas asam nukleat target bisa kedadeyan amarga kahanan pengiriman lan/utawa panyimpenan sadurungé persiapan sampel. Utamane, suhu sing dhuwur utawa panyimpenan sing ora cukup bisa nyebabake karusakan sel lan asam nukleat. Fiksasi sel lan jaringan sarta penyisipan parafin minangka panyebab fragmentasi DNA sing wis dikenal lan masalah sing terus-terusan (waca Gambar 1 lan 2). Ing kasus iki, sanajan isolasi lan pemurnian sing optimal ora bakal mbantu.

Gambar 1 | Efek imobilisasi marang integritas DNA
Elektroforesis gel agarose nuduhake yen kualitas DNA sing diisolasi saka bagean parafin otopsi beda-beda banget. DNA kanthi dawa fragmen rata-rata sing beda-beda ana ing ekstrak gumantung saka metode fiksasi. DNA mung diawetake nalika difiksasi ing sampel beku asli lan ing formalin netral sing di-buffer. Panggunaan fiksatif Bouin sing asam banget utawa formalin sing ngandhut asam format sing ora di-buffer nyebabake mundhut DNA sing signifikan. Fraksi sing isih ana akeh banget sing terfragmentasi.
Ing sisih kiwa, dawane fragmen dinyatakake ing pasangan kilobase (kbp)

Gambar 2 | Mundhut integritas target asam nukleat
(a) Celah 3′-5′ ing loro untaian bakal nyebabake pedhot ing DNA target. Sintesis DNA isih bakal kedadeyan ing fragmen cilik kasebut. Nanging, yen situs annealing primer ora ana ing fragmen DNA, mung amplifikasi linier sing kedadeyan. Ing kasus sing paling disenengi, fragmen kasebut bisa saling jenuh, nanging asil bakal cilik lan ing ngisor tingkat deteksi.
(b) Ilangé basa, utamane amarga depurinasi lan pembentukan dimer timidin, nyebabake penurunan jumlah ikatan-H lan penurunan Tm. Sajrone fase pemanasan sing dawa, primer bakal leleh saka DNA matriks lan ora bakal anil sanajan ing kahanan sing kurang ketat.
(c) Basa timin sing jejer mbentuk dimer TT.
Masalah umum liyané sing kerep kedadeyan ing diagnostik molekuler yaiku pelepasan asam nukleat target sing kurang optimal dibandhingake karo ekstraksi fenol-kloroform. Ing kasus sing ekstrem, iki bisa digandhengake karo negatif palsu. Akeh wektu sing bisa dihemat kanthi lisis sing nggodhog utawa pencernaan enzimatik saka lebu sel, nanging cara iki asring nyebabake sensitivitas PCR sing kurang amarga pelepasan asam nukleat sing ora cukup.

Inhibisi aktivitas polimerase sajrone amplifikasi

Umumé, inhibisi digunakaké minangka konsep wadhah kanggo njlèntrèhaké kabèh faktor sing ndadèkaké asil PCR suboptimal. Ing pangertèn biokimia sing ketat, inhibisi diwatesi mung ing aktivitas enzim, yaiku, ngurangi utawa nyegah konversi produk substrat liwat interaksi karo situs aktif DNA polimerase utawa kofaktoré (contone, Mg2+ kanggo Taq DNA polimerase).
Komponen ing sampel utawa macem-macem buffer lan ekstrak sing ngemot reagen bisa langsung nyegah enzim utawa njebak kofaktor (kayata EDTA), saengga ngnonaktifake polimerase lan banjur nyebabake asil PCR sing mudhun utawa negatif palsu.
Nanging, akeh interaksi antarane komponen reaksi lan asam nukleat sing ngemot target uga ditetepake minangka 'inhibitor PCR'. Sawise integritas sel kaganggu dening isolasi lan asam nukleat dirilis, interaksi antarane sampel lan larutan sekitar lan fase padat bisa kedadeyan. Contone, 'pembungkus' bisa ngiket DNA untaian tunggal utawa ganda liwat interaksi non-kovalen lan ngganggu isolasi lan pemurnian kanthi nyuda jumlah target sing pungkasane tekan pembuluh reaksi PCR.
Umumé, inhibitor PCR ana ing umumé cairan awak lan reagen sing digunakaké kanggo tes diagnostik klinis (urea ing urin, hemoglobin lan heparin ing getih), suplemen panganan (komponen organik, glikogen, lemak, ion Ca2+) lan komponen ing lingkungan (fenol, logam abot).

Inhibitor PCR sing luwih umum bisa ditemokake ing bakteri lan sel eukariotik, DNA non-target, makromolekul sing ngiket DNA saka matriks jaringan lan peralatan laboratorium kayata sarung tangan lan plastik. Pemurnian asam nukleat sajrone utawa sawise ekstraksi minangka cara sing luwih disenengi kanggo mbusak inhibitor PCR.
Saiki, maneka warna peralatan ekstraksi otomatis bisa ngganti akeh protokol manual, nanging pemulihan lan/utawa pemurnian target 100% durung nate bisa digayuh. Inhibitor potensial bisa uga isih ana ing asam nukleat sing dimurnèkaké utawa bisa uga wis ditrapake. Ana macem-macem strategi kanggo nyuda dampak inhibitor. Pilihan polimerase sing cocog bisa duwe pengaruh sing signifikan marang aktivitas inhibitor. Cara liya sing wis kabukten kanggo nyuda inhibisi PCR yaiku nambah konsentrasi polimerase utawa ngetrapake aditif kayata BSA.
Inhibisi reaksi PCR bisa dituduhake kanthi nggunakake kontrol kualitas proses internal (IPC).
Kudu ati-ati nalika mbusak kabeh reagen lan larutan liyane ing kit ekstraksi, kayata etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol lan fenol, saka isolat asam nukleat kanthi langkah pencucian sing tliti. Gumantung saka konsentrasine, bahan-bahan kasebut bisa ngaktifake utawa nyegah PCR.