Faktor interferensi ing reaksi PCR

Sajrone reaksi PCR, sawetara faktor sing ngganggu asring ditemoni.
Amarga sensitivitas PCR sing dhuwur banget, kontaminasi dianggep minangka salah sawijining faktor sing paling penting sing mengaruhi asil PCR lan bisa ngasilake asil positif palsu.
Sing padha kritis yaiku macem-macem sumber sing nyebabake asil negatif palsu. Yen siji utawa luwih bagean penting saka campuran PCR utawa reaksi amplifikasi dhewe dicegah utawa diganggu, tes diagnostik bisa dicegah. Iki bisa nyebabake nyuda efisiensi lan malah asil negatif palsu.
Saliyane inhibisi, ilang integritas asam nukleat target bisa kedadeyan amarga kondisi pengiriman lan/utawa panyimpenan sadurunge persiapan sampel. Utamane, suhu dhuwur utawa panyimpenan sing ora nyukupi bisa nyebabake karusakan sel lan asam nukleat. Fiksasi sel lan jaringan lan embedding parafin minangka panyebab fragmentasi DNA lan masalah sing terus-terusan (pirsani Gambar 1 lan 2). Ing kasus kasebut, malah isolasi lan pemurnian optimal ora bakal mbantu.

Gambar 1 | Efek imobilisasi ing integritas DNA
Elektroforesis gel agarose nuduhake yen kualitas DNA sing diisolasi saka bagean parafin saka autopsi beda-beda. DNA saka dawa fragmen rata-rata beda ana ing ekstrak gumantung saka cara fiksasi. DNA disimpen mung nalika tetep ing sampel beku asli lan ing formalin netral buffered. Panganggone fiksatif Bouin sing asam banget utawa ora buffer, formalin sing ngandhut asam format nyebabake mundhut DNA sing signifikan. Fraksi sing isih ana banget pecah.
Ing sisih kiwa, dawa fragmen ditulis ing pasangan kilobase (kbp)

Gambar 2 | Mundhut integritas target asam nukleat
(a) Celah 3′-5′ ing loro untaian bakal nyebabake karusakan ing DNA target. sintesis DNA isih bakal kelakon ing fragmen cilik. Nanging, yen situs anil primer ora ana ing fragmen DNA, mung amplifikasi linier sing kedadeyan. Ing kasus sing paling disenengi, fragmen bisa resaturate saben liyane, nanging asil bakal cilik lan ngisor tingkat deteksi.
(b) Kehilangan basa, utamane amarga depurinasi lan pembentukan dimer timidin, nyebabake nyuda jumlah ikatan H lan nyuda Tm. Sajrone fase pemanasan elongated, primer bakal ilang saka DNA matriks lan ora bakal anil sanajan ing kahanan sing kurang kenceng.
(c) Basa timin jejer mbentuk dimer TT.
Masalah umum liyane sing asring kedadeyan ing diagnostik molekuler yaiku pelepasan asam nukleat target sing kurang optimal dibandhingake karo ekstraksi fenol-kloroform. Ing kasus sing ekstrem, iki bisa digandhengake karo negatif palsu. Akeh wektu bisa disimpen kanthi lysis nggodhok utawa pencernaan enzimatik saka lebu sel, nanging cara iki asring nyebabake sensitivitas PCR sing kurang amarga pelepasan asam nukleat ora cukup.

Inhibisi aktivitas polimerase sajrone amplifikasi

Umumé, inhibisi digunakake minangka konsep wadhah kanggo njlèntrèhaké kabeh faktor sing nyebabake asil PCR suboptimal. Ing pangertèn biokimia sing ketat, inhibisi diwatesi kanggo aktivitas enzim, yaiku, nyuda utawa nyegah konversi produk substrat liwat interaksi karo situs aktif polimerase DNA utawa kofaktor (contone, Mg2+ kanggo polimerase DNA Taq).
Komponen ing sampel utawa macem-macem buffer lan ekstrak sing ngemot reagen bisa langsung nyandhet enzim utawa njebak kofaktor (umpamane EDTA), saengga polimerase ora aktif lan nyebabake asil PCR negatif utawa palsu.
Nanging, akeh interaksi antarane komponen reaksi lan asam nukleat sing ngemot target uga ditetepake minangka 'inhibitor PCR'. Sawise integritas sel diganggu dening isolasi lan asam nukleat dibebasake, interaksi antara sampel lan solusi ing sakubenge lan fase padat bisa kedadeyan. Contone, 'pemulung' bisa ngiket DNA untai siji utawa ganda liwat interaksi non-kovalen lan ngganggu isolasi lan pemurnian kanthi ngurangi jumlah target sing pungkasane tekan wadhah reaksi PCR.
Umume, inhibitor PCR ana ing pirang-pirang cairan lan reagen awak sing digunakake kanggo tes diagnostik klinis (urea ing urin, hemoglobin lan heparin ing getih), suplemen panganan (komponen organik, glikogen, lemak, ion Ca2+) lan komponen ing lingkungan (phenols). logam abot)

Inhibitor PCR sing luwih umum bisa ditemokake ing bakteri lan sel eukariotik, DNA non-target, makromolekul DNA-binding matriks jaringan lan peralatan laboratorium kayata sarung tangan lan plastik. Pemurnian asam nukleat sajrone utawa sawise ekstraksi minangka cara sing disenengi kanggo ngilangi inhibitor PCR.
Saiki, macem-macem peralatan ekstraksi otomatis bisa ngganti akeh protokol manual, nanging 100% pemulihan lan / utawa pemurnian target durung nate ditindakake. Inhibitor potensial bisa uga isih ana ing asam nukleat sing diresiki utawa bisa uga wis ditrapake. Ana macem-macem strategi kanggo nyuda pengaruh inhibitor. Pilihan polimerase sing cocog bisa nduwe pengaruh sing signifikan marang aktivitas inhibitor. Cara liya sing bisa dibuktekake kanggo nyuda inhibisi PCR yaiku nambah konsentrasi polimerase utawa nggunakake aditif kayata BSA.
Inhibisi reaksi PCR bisa dituduhake kanthi nggunakake kontrol kualitas proses internal (IPC).
Kudu ati-ati kanggo mbusak kabeh reagen lan solusi liyane ing kit ekstraksi, kayata etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol lan phenol, saka isolat asam nukleat kanthi langkah ngumbah kanthi teliti. Gumantung saka konsentrasi, bisa ngaktifake utawa nyandhet PCR.