Faktor Interferensi ing Reaksi PCR

Sajrone reaksi PCR, sawetara faktor interfer asring ditemoni.
Amarga sensitivitas PCR, kontaminasi dianggep minangka salah sawijining faktor sing penting sing mengaruhi asil PCR lan bisa ngasilake asil positif palsu.
Kanthi kritis padha yaiku macem-macem sumber sing nyebabake asil palsu-negatif. Yen siji utawa luwih bagean saka campuran PCR utawa reaksi amplifikasi dhewe sing disandhak utawa disegel, assay diagnosa bisa dicegah. Iki bisa nyebabake nyuda efisiensi lan asil negatif palsu.
Saliyane inhibition, kerugian integritas asam nukleat bisa kedadeyan amarga dikirim lan / utawa kahanan panyimpenan sadurunge persiapan sampel. Utamane, suhu suhu sing dhuwur utawa panyimpenan sing ora cocog bisa nyebabake karusakan sel lan asam nukle. Fiksasi sel lan jaringan nampilake nyebabake fragmen DNA lan masalah sing terus-terusan (deleng tokoh 1 lan 2). Ing kasus kasebut, sanajan pamisahan lan pemurnian sing optimal ora bakal mbantu.

Gambar 1 | Efek immobilisasi ing integritas DNA
Elektrophoresis gelar Agarose nuduhake manawa kualitas DNA terisolasi saka bagean parafin autopsies beda-beda. DNA saka dawane rata-rata dawane rata-rata saiki ana ing ekstrak gumantung saka cara fiksasi. DNA mung disimpen nalika tetep ing conto beku asli lan ing formal netral sing bedhil. Panganggone fixative bouin utawa ora ana asam sing ngemot asam sing kuwat, asam sing ngemot asam sing beda-beda nyebabake ilang DNA sing signifikan. Sisa sisa sisa banget.
Ing sisih kiwa, dawane fragmen dirajang ing pasangan kilegase (KBP)

Gambar 2 | Mundhut integritas target asam nukleat
(a) celah 3'-5 'ing loro lembar bakal nyebabake istirahat ing Target DNA. Sintesis DNA isih bakal kedadeyan ing fragmen cilik. Nanging, yen situs panyebaran primer wis ilang ing fragmen DNA, mung ampliifices linear. Ing kasus sing paling disenengi, fragmen bisa uga nyuwil-luwih, nanging panenan bakal dadi level deteksi cilik lan ngisor.
(b) Mundhut dhasar, utamane amarga depurasi lan pembentukan panyeratan thymidine, ndadékaké nyuda jumlah jaminan lan suda ing TM. Sajrone fase pemanasan gedhe, primer bakal ilang saka matriks DNA lan ora bakal nyilikake sanajan kurang kahanan sing kurang.
(c) dhasar thyine jejer mbentuk tt dimer.
Masalah umum liyane sing asring dumadi ing diagnosa molekul yaiku pelepasan asam target target tinimbang ekstraksi phenol-kloror. Ing kasus sing nemen, iki bisa digandhengake karo negatives palsu. Akeh wektu sing bisa disimpen kanthi nggodhok lysis utawa pencernaan enzim, nanging cara iki asring nyebabake sensitivitas PCR sing kurang amarga ora ana rilis asam nukleat.

Nyandhet kegiatan polymerase sajrone amplification

Umumé, pencegahan digunakake minangka konsep kontan kanggo njlentrehake kabeh faktor sing nyebabake asil PCROPTIMAL. Ing pangerten biokimia, pencegahan diwatesi kanggo kegiatan enzim, yaiku, nyuda konversi produk kanthi subtrat liwat interaksi karo polimerase DNA utawa koma kanggo polimerase Taq (kayata, MG2 + kanggo polimerase taq).
Komponen ing sampel utawa macem-macem buffer lan ekstrak sing ngemot reagen utawa nglereni kofactors (contone edta), saengga ora bisa nuwuhake polimer lan negesake kanthi asil PCR.
Nanging, akeh interaksi antarane komponen reaksi lan target akids nuklir uga ditunjuk minangka 'inhibitor PCR'. Sawise integritas sel kasebut diganggu karo pamisahan lan asam nukleik dibebasake, interaksi ing antarane sampel lan solusi sing ana ing sekitar. Contone, 'scavenger' bisa ngiket tunggal- utawa DNA DNA sing tikel kaping pindho liwat interaksi non-covalent lan ngganggu pamisahan lan pemurnian kanthi nyuda target sing bisa ditindakake.
Umumé, inhibitor PCR saiki ana ing cairan awak lan reagen sing digunakake kanggo tes diagnostik klinis (urine ing urin, hemoglobin, hemoglobin, glikogen, lemak, lemak, lemak, logam, logam sing abot)

Inhibitor PCR sing luwih umum bisa ditemokake ing sel bakteri lan eukaryotik, DNA-naleni makam saka Matrik DNA-naleni lan peralatan laboratorium kayata sarung tangan lan plastik. Purifikasi asam nukleat sajrone utawa sawise ekstraksi yaiku cara sing disenengi kanggo mbusak inhibitor PCR.
Dina iki, macem-macem peralatan ekstraksi otomatis bisa ngganti protokol manual, nanging 100% Recovery lan / utawa pemurnian target durung bisa digayuh. Potensial inhibitor bisa uga isih ana ing asam nuklir sing diresiki utawa bisa uga wis ditrapake. Strategi beda ana kanggo nyuda pengaruh inhibitor. Pilihan saka polimerase sing cocog bisa duwe pengaruh sing signifikan ing kegiatan inhibitor. Cara sing bisa dibatalake kanggo nyuda pencegahan PCR yaiku nambah konsentrasi polirase utawa nglamar aditif kayata BSA.
Penyambungan reaksi PCR bisa dituduhake kanthi nggunakake kontrol kualitas kualitas internal (IPC).
Care kudu dicopot kanggo ngilangi kabeh reagen lan solusi liyane ing kit ekstraksi, kayata ontanol, ajta, cetab, licl, guscn, saka ajel, isolate asian nukleik kanthi langkah cuci kanthi tuntas. Gumantung saka konsentrasi, bisa uga ngaktifake utawa nyandhet PCR.